Shell morphological diversification patterns and molecular systematics of the testate amoebae orders Arcellinida and Euglyphida

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de Lectura: 09-03-2023Para inferir los patrones generales que rigen la biodiversidad es necesario tener una buena representación de los taxones que la componen, y esto incluye también a los organismos más pequeños. Si bien se puede argumentar que el conocimiento de ciertos grupos de plantas y animales puede ser insuficiente, existe un claro vacío de conocimiento en los protistas, especialmente en el suelo y agua dulce. Para resolver esta “laguna” de conocimiento, esta tesis propone centrarse en un grupo particular de protistas que viven principalmente en ecosistemas continentales, las amebas tecadas. Pero para ello, es necesario resolver algunas faltas de conocimiento y desarrollar protocolos específicos para el estudio rápido y eficiente de la biodiversidad en estos taxones. La ausencia de tales protocolos limita enormemente su estudio, así como sus potenciales aplicaciones. Las amebas tecadas son un grupo parafilético de protistas ameboides que tienen en común un “caparazón” o teca autoconstruida. Estos organismos constituyen órdenes dentro de "supergrupos" eucariotas muy poco relacionados; Arcellinida en Amebozoa, Euglyphida y Thecofilosea en Rhizaria y Amphitremida en Stramenopiles (=Heterokonta). Dentro de cada grupo, estos organismos difieren en la composición y forma de las tecas, que constituyen la base de su taxonomía y sistemática. Intuitivamente, los investigadores han clasificado a los organismos asumiendo que morfologías de la teca similares deberían compartir un ancestro común. Esta suposición se basa en la hipótesis de que las tecas están sometidas a una selección neutral, y descarta la posibilidad de convergencias evolutivas entre especies o clados. Sin embargo, el “barcoding” molecular ha desafiado la sistemática y la taxonomía clásicas basadas en la morfología, mostrando patrones de diversificación morfológica de las tecas mucho más complejos y enmarañadas de lo que se pensaba. Estos resultados subrayan la necesidad de aplicar un enfoque molecular para caracterizar los taxones y establecer las relaciones entre ellos. Sin embargo, por el momento, casi todos los datos moleculares disponibles son de un único infraorden dentro de Arcellinida, los Hyalospheniformes. En Euglyphida, sólo el infraorden Euglyphina ha sido (relativamente) bien muestreado molecularmente. El primer objetivo de esta tesis es aumentar la base de datos molecular de las amebas tecadas, centrándose en Arcellinida y Euglyphida, recuperando las regiones genéticas 18S rRNA, COI y NADH. Dentro de estos genes que se han utilizado, el gen nuclear 18S rRNA fue el más conservado. También ha sido el más útil para la reconstrucción de relaciones más profundas, aunque demasiado conservado para discriminar entre especies. Por este motivo, nos centramos en el gen mitocondrial COI, de rápida evolución, que a su vez permite una buena resolución a nivel de especie. Siguiendo los principios de la taxonomía integrativa, también obtuvimos (además de las secuencias moleculares) datos sobre su localización, ecología y morfología de la teca. Esta tesis incluye los primeros datos moleculares para amebas tecadas de la Península Ibérica, tanto en ambientes de agua dulce, suelos, como de sedimentos marinos. También incluyen los primeros datos moleculares para géneros como Plagiopyxis o Trigonopyxis . Estas bases de datos servirán de antecedente para futuros estudios, y serán fundamentales para responder a dos preguntas que estructuran esta tesis: 1) "¿Cómo evoluciona la morfología de la teca en las amebas tecadas?": Entender los patrones de diversificación en las amebas tecadas es esencial para aclarar su taxonomía y sistemática, así como la aplicación de sus rasgos funcionales en los análisis ecológicos. Aquí nos centramos en la familia Cyphoderiidae (Euglyphida), Arcellidae (Arcellinida) y otros taxones de Arcellinida. Evaluamos las relaciones filogenéticas entre los taxones basándonos en datos moleculares y “mapeamos” las morfologías de las tecas y la ecología de los organismos en los árboles filogenéticos. Nuestros resultados muestran correlaciones entre ambientes y morfotipos, aportando varios casos de patrones convergentes. Esto sugiere que algunos rasgos de la teca pueden estar bajo selección positiva. 2) "¿Cómo generar datos moleculares de forma rápida y eficiente en Arcellinida?": La obtención de datos moleculares en amebas tecadas siempre ha sido un problema importante, debido a las dificultades de trabajar con estos organismos (en su mayoría) no cultivables. En consecuencia, la obtención de datos moleculares sobre las amebas tecadas es costosa en términos de tiempo y dinero, lo que explica en gran medida que sigan siendo relativamente poco estudiadas en comparación con otros grupos de protistas. Para resolver este problema, diseñamos un protocolo específico para obtener datos de ADN ambiental de Arcellinida, basado en los datos disponibles. Con este protocolo molecular específico de Arcellinida, se espera obtener cientos de secuencias ambientales mediante técnicas de “secuenciación de alto rendimiento”. Esto permitirá realizar experimentos ecológicos y biogeográficos de gran tamaño, así como estudios de bioindicación, todo lo cual requiere cantidades considerables de datos que eran imposibles de obtener en el pasado. Esta tesis aporta una nueva perspectiva integral de la historia evolutiva y la diversificación morfológica de las tecas de los órdenes Arcellinida y Euglyphida existentes; destacando la importancia de incorporar a los protistas, como las amebas tecadas, a la hora de sacar conclusiones generales que se apliquen a los eucariotas o a la biodiversidad en genera

Viral RNA load in plasma is associated with critical illness and a dysregulated host response in COVID‑19

Background. COVID-19 can course with respiratory and extrapulmonary disease. SARS-CoV-2 RNA is detected in respiratory samples but also in blood, stool and urine. Severe COVID-19 is characterized by a dysregulated host response to this virus. We studied whether viral RNAemia or viral RNA load in plasma is associated with severe COVID-19 and also to this dysregulated response. Methods. A total of 250 patients with COVID-19 were recruited (50 outpatients, 100 hospitalized ward patients and 100 critically ill). Viral RNA detection and quantification in plasma was performed using droplet digital PCR, targeting the N1 and N2 regions of the SARS-CoV-2 nucleoprotein gene. The association between SARS-CoV-2 RNAemia and viral RNA load in plasma with severity was evaluated by multivariate logistic regression. Correlations between viral RNA load and biomarkers evidencing dysregulation of host response were evaluated by calculating the Spearman correlation coefficients. Results. The frequency of viral RNAemia was higher in the critically ill patients (78%) compared to ward patients (27%) and outpatients (2%) (p < 0.001). Critical patients had higher viral RNA loads in plasma than non-critically ill patients, with non-survivors showing the highest values. When outpatients and ward patients were compared, viral RNAemia did not show significant associations in the multivariate analysis. In contrast, when ward patients were compared with ICU patients, both viral RNAemia and viral RNA load in plasma were associated with critical illness (OR [CI 95%], p): RNAemia (3.92 [1.183–12.968], 0.025), viral RNA load (N1) (1.962 [1.244–3.096], 0.004); viral RNA load (N2) (2.229 [1.382–3.595], 0.001). Viral RNA load in plasma correlated with higher levels of chemokines (CXCL10, CCL2), biomarkers indicative of a systemic inflammatory response (IL-6, CRP, ferritin), activation of NK cells (IL-15), endothelial dysfunction (VCAM-1, angiopoietin-2, ICAM-1), coagulation activation (D-Dimer and INR), tissue damage (LDH, GPT), neutrophil response (neutrophils counts, myeloperoxidase, GM-CSF) and immunodepression (PD-L1, IL-10, lymphopenia and monocytopenia). Conclusions. SARS-CoV-2 RNAemia and viral RNA load in plasma are associated with critical illness in COVID-19. Viral RNA load in plasma correlates with key signatures of dysregulated host responses, suggesting a major role of uncontrolled viral replication in the pathogenesis of this disease.This work was supported by awards from the Canadian Institutes of Health Research, the Canadian 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding initiative (CIHR OV2 – 170357), Research Nova Scotia (DJK), Atlantic Genome/Genome Canada (DJK), Li-Ka Shing Foundation (DJK), Dalhousie Medical Research Foundation (DJK), the “Subvenciones de concesión directa para proyectos y programas de investigación del virus SARS‐CoV2, causante del COVID‐19”, FONDO–COVID19, Instituto de Salud Carlos III (COV20/00110, CIBERES, 06/06/0028), (AT) and fnally by the “Convocatoria extraordinaria y urgente de la Gerencia Regional de Salud de Castilla y León, para la fnanciación de proyectos de investigación en enfermedad COVID-19” (GRS COVID 53/A/20) (CA). DJK is a recipient of the Canada Research Chair in Translational Vaccinology and Infammation. APT was funded by the Sara Borrell Research Grant CD018/0123 funded by Instituto de Salud Carlos III and co-fnanced by the European Development Regional Fund (A Way to Achieve Europe programme). The funding sources did not play any role neither in the design of the study and collection, not in the analysis, in the interpretation of data or in writing the manuscript

Arcellinida testate amoebae as climate miner's canaries in Southern Spain

Southern Spain is currently under threat of desertification as a consequence of global climate change, which pressures on fragile ecosystems such as caves. The organisms living in these extremely stable environments are particularly sensitive and prone to extinction, therefore they can be used as bioindicators for climate change. Cyanobacterial mats form peculiar and vulnerable micro-ecosystems at the entrance of caves and house a diversity of protists. Amongst them, Arcellinida testate amoebae have been traditionally used as bioindicators for environmental quality, notably because their narrow ecological tolerance and their key ecological position as top predators of the microbial foodwebs. We report here two new species of Arcellinida found in the cyanobacterial mats of cave Hundidero, in Sierra de Grazalema, Malaga province, whose traits suggest a narrow tolerance for changes in humidity. We provide a formal description for Difflugia alhadiqa sp. nov. and Heleopera baetica sp. nov. based on morphometrics and 18S rRNA gene data, and propose using the presence of these species to indicate the good health of the cyanobacterial mats, like miner's canaries for local climate

Multiple convergences in the evolutionary history of the testate amoeba family Arcellidae (Amoebozoa: Arcellinida: Sphaerothecina): when the ecology rules the morphology

Protists are probably the most species-rich eukaryotes, yet their systematics are inaccurate, leading to an underestimation of their actual diversity. Arcellinida (= lobose testate amoebae) are amoebozoans that build a test (a hard shell) whose shape and composition are taxonomically informative. One of the most successful groups is Arcellidae, a family found worldwide in many freshwater and terrestrial environments where they are indicators of environmental quality. However, the systematics of the family is based on works published nearly a century ago. We re-evaluated the systematics based on single-cell barcoding, morphological and ecological data. Overall, test shape appears to be more related to environmental characteristics than to the species’ phylogenetic position. We show several convergences in organisms with similar ecology, some traditionally described species being paraphyletic. Based on conservative traits, we review the synapomorphies of the infraorder Sphaerothecina, compile a list of synonyms and describe a new genus Galeripora, with five new combinations. Seven new species: Arcella guadarramensis sp. nov., Galeripora balari sp. nov., Galeripora bufonipellita sp. nov., Galeripora galeriformis sp. nov., Galeripora naiadis sp. nov., Galeripora sitiens sp. nov. and Galeripora succelli sp. nov. are also described here.This work was funded by the Spanish Government PGC2018-094660-B-I00 (MCIU/AEI/FEDER,UE) and the program ‘Atracción de Talento Investigador’, grant awarded by the Consejería de Educación, Juventud y Deporte, Comunidad de Madrid (Spain) (2017-T1/AMB-5210).Peer reviewe

Speciation patterns in the Forficula auricularia species complex: cryptic and not so cryptic taxa across the western Palaearctic region

Forficula auricularia (the European earwig) is possibly a complex of cryptic species. To test this hypothesis, we performed: (1) a phylogeographic study based on fragments of the mitochondrial COI and the nuclear ITS2 markers on a wide geographic sampling, (2) morphometric analyses of lineages present in Spain and (3) niche overlap analyses. We recovered five reciprocally monophyletic ancient phylogroups with unique historical patterns of distribution, climatic niches and diversification. External morphology was conserved and not correlated with speciation events, except in one case. Phylogenetic placement of the morphologically distinct taxon renders F. auricularia paraphyletic. Based on the congruence of the phylogenetic units defined by mtDNA and nuclear sequence data, we conclude that phylogroups have their own historical and future evolutionary trajectory and represent independent taxonomic units. Forficula auricularia is a complex of at least four species: the morphologically diagnosable Forficula aeolicaGonzález-Miguéns & García-París sp. nov., and the cryptic taxa: Forficula mediterranea González-Miguéns & García-París sp. nov., Forficula dentataFabricius, 1775 stat. nov. and Forficula auriculariaLinnaeus, 1758 s.s. New synonymies of F. dentata are also proposed.PMP is supported by the Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-Fondo Europeo de Desarrollo Regional (MICIU-FEDER) through contract BES-2016-077777. This work was funded by the project grant CGL2015-66571-P (MICIN-FEDER) of Spain to MG-P